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磁珠法核酸提取及常见的6种误区

2021.02.04 842次 作者:admin 来源:

人类对核酸物质的了解始于1869年,这一年Friederich Miescher从白细胞的细胞核中分离出一种他称之为“核素”的化学物质,这是人类历史上第一次有目的地提取细胞内的核物质,然而当时采用的方法十分简单,仅仅是通过改变溶液的酸碱度,核酸便从酸性溶液中沉淀出来。这也是最早对核酸性质的描述,即是一种溶于碱性溶液,但不溶于酸性溶液的物质。

 

1953年,Watson和Crick阐明了DNA的结构,从此开启了分子生物学的元年。此后不久,出现了分离核酸的标准实验室程序。1958年,发现DNA半保留复制原理的Meselson和Stahl开创性地应用密度梯度离心法获得DNA。这种方法利用离心力场中各组分的浮力密度差不同的原理进行DNA纯化。由于铯离子(Cs)相对于水的密度更大,施加到CsCl溶液的超高离心力导致形成密度梯度。核酸在这个梯度上迁移,直到达到中性浮力,即等密度点。该方法具有以低成本提供非常纯的高产DNA的优点。


其它的液相纯化方法还包括经典的苯酚-氯仿法、CTAB法等。


但直到二十世纪90年代,DNA提取仍然是耗时、繁琐、低效率的操作。1989年,McCormick建立了一种用酚化的二氧化硅吸附去除蛋白质的基因组DNA提取方法。它类似经典的酚/氯仿提取法,即用酚化的二氧化硅酚代替酚,这是最早出现的固相吸附提取方法。相比起液相抽提,固相吸附法的优势很明显,因此传统的液相分离提取核酸方法逐渐被以固相吸附支持物为基础的新方法所取代。目前常见固相材料有硅胶、玻璃颗粒、硅藻土、阴离子交换载体等。但固相法通常需采取数次快速离心、真空抽滤等步骤来实现分离,而且对于样本需求量大,耗费样品较多,不便于高通量、自动化操作,严重限制了在临床基因诊断领域的应用。


理想的核酸提取方法应该满足以下4个条件:

1)灵敏、快速、简单、重复性好;

2)产物纯度较高,不影响后续步骤

3)环保、无毒害

4)无交叉污染风险


为了适应现代分子生物学检测实验高通量、高灵敏度、自动化操作的需要,磁珠法应运而生。第一个利用磁珠法提取DNA的并且在美国成功申请专利的商品化试剂出现在1998年。磁珠法先通过裂解细胞,将游离出来的核酸分子特异地吸附到磁性颗粒表面,而蛋白质、多糖等杂质则留在溶液中;在外加磁场的作用下,磁性颗粒与液体分开,弃除液体后,再经洗脱即得到纯化的核酸分子。


磁珠法利用了磁性颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理,尽可能地避免了提取过程中核酸的丢失,还能很好地去除标本中存在的干扰物质(如血红蛋白、胆红素及脂血等因素)影响,获得质量较高的核酸模板。随着磁珠法提取技术的发展,DNA提取才真正开始实现标准化、快速化和自动化。


而基于磁珠法提取的商业试剂盒也得到广泛应用。这种试剂盒不需要任何有机溶剂,无需重复离心,目前可以从全血、血清、血浆、唾液、尿液、粪便、脑脊液、组织和细胞中提取高质量的DNA和RNA,且耗时更短、回收率更高。最显著的优势是可以通过机械设备实现提取过程自动化和无人源干扰。


近年来分子诊断技术快速发展,随着基因测序等技术的成熟,成本进一步降低,在临床上的应用也越来越普遍。分子诊断检测的样本类型多达数十种,而处理后产物适用的检测项目也涵盖了荧光定量PCR、基因测序、基因芯片、生物质谱等各类分子生物学技术平台。然而,无论是哪一类检测项目,准确的检验结果无疑依赖于高质量的标本及标本前处理过程。因此临床分子诊断自动化趋势将逐步在国内临床实验室成为主导,而自动化首先将在目前手工操作较普及且对结果影响最大的核酸提取上实现。磁珠法提取试剂加自动核酸提取仪,就成为解决临床分子诊断样品前处理的完美组合。


然而,使用生物磁珠提取核酸的过程中,也存在着一些误区。


01

误区1:磁珠越多,提取效果越好


有很多老师喜欢在提取效果不佳的时候,增加磁珠的用量,认为磁珠多加一点,就能吸上更多的核酸,不得不说这种想法是不可取的。

磁珠的主要特点是既可以分散于液体中,也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离,任何试剂体系,磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的,超过一定的比例,过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中,而丧失其分散的特性,也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。
而过量的磁珠也会吸附更多的杂质,对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候,过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分,导致整个试剂盒效率低下。有很多时候,在提取效果不佳的时候,减少磁珠使用量,反而是提升提取效果的最优途径。

通常情况下,磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的,因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多,但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好,是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。
02

误区2:试剂使用的越多,提取效果越好


裂解效果不好?多加点裂解液。洗涤效果不好?多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。

但是对于磁珠法而言,每增加一部分液体体积,就减少了更多的磁珠碰撞几率,而降低磁珠碰撞几率,会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候,虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的,所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。

03

误区3:洗涤次数越多,提取效果越好


提取得到的核酸杂质过多时,使用者会考虑多进行几次洗涤,以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸,但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸,且增加了核酸断裂水解的可能性,所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。


04

误区4:样本取用的越多,提取效果越好


在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下,往往核酸提取效果不好,很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。

但简单地增加样本取样量,有时会引入过多的杂质,超出裂解液裂解能力,也会使提取效率降低,所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。
如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低,建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性,使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。
05

误区5:某一种磁珠好,就应该在所有试验中效果都好


磁珠的种类是多种多样的,粒径大小不同,分散性不同,磁响应时间不同,包被基础基质不同,外层修饰官能团不同,包被密度不同,官能团臂长不同,会导致磁珠特性千差万别。
所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂,配方也并不完全相同,同样应用于核酸提取的磁珠,性质也并非完全一致。
有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率,有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系,有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快,更适合磁棒式自动提取仪;有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长,更适合移液式自动提取仪。
很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况,除了固定的试剂盒配合,多数情况下,磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。
06

和某种试剂盒对比效果不好,就是磁珠不好


很多客户在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下,简单地等量替换磁珠,用于比较磁珠效果。
这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论,但实际上,由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的,往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。
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